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新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）因其獨(dú)特的不對(duì)稱分裂特征常被用于研究細(xì)胞分化、極性分裂以及與細(xì)胞周期相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，被認(rèn)為是研究單細(xì)胞向多細(xì)胞生命轉(zhuǎn)變的模式微生物。然而，新月柄桿菌的遺傳操作手段費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且效率低，嚴(yán)重影響了對(duì)其深入研究的潛能。

近日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所趙國屏院士，趙維研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海交通大學(xué)在Nucleic Acids Research上發(fā)表題為“A CRISPR/SpCas9M-reporting system for efficient and rapid genome editing in?Caulobacter crescentus”的方法論文，針對(duì)上述問題，開發(fā)了一套基于CRISPR/_SpCas9M的基因編輯報(bào)告系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)新月柄桿菌高效、快速且無痕的基因編輯。該項(xiàng)工作不僅為新月柄桿菌的遺傳操作提供了強(qiáng)有力的工具，也為解決其它難以進(jìn)行遺傳操作的非模式菌提供了新的技術(shù)思路和方法學(xué)參考。

設(shè)計(jì)：CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)

研究團(tuán)隊(duì)最初構(gòu)建了一個(gè)基于同源重組（HR）的CRISPR/Cas系統(tǒng)。將Streptococcus pyogenes來源的_SpCas9、sgRNA和同源臂（H-arms）克隆至攜帶pBBR1復(fù)制子的復(fù)制型質(zhì)粒pBXMCS2中。為了實(shí)現(xiàn)無痕編輯，在同源臂之間未設(shè)計(jì)任何抗生素抗性基因。然而，將該編輯質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至新月柄桿菌后，發(fā)現(xiàn)獲得極少甚至無菌落，并且存活菌株的靶位點(diǎn)均未發(fā)生預(yù)期編輯。這表明CRISPR/_SpCas9的切割具有致死性，而該菌細(xì)胞內(nèi)的同源重組（HR）效率又相對(duì)較低。

為實(shí)現(xiàn)有效的靶向基因編輯，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)編輯質(zhì)粒進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，并圍繞三個(gè)關(guān)鍵方向進(jìn)行了優(yōu)化。

首先，研究人員篩選了來自不同物種的Cas蛋白，包括Streptococcus pyogenes?Cas9 (_SpCas9)、Francisella novicida?Cas12a (_FnCas12a),?Streptococcus thermophilus?CRISPR1-Cas9 (_Sth1Cas9)和Streptococcus thermophilus?CRISPR3-Cas9 (_Sth3Cas9)，以評(píng)估它們?cè)谛略卤鷹U菌中的編輯效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述所有Cas蛋白均未檢測(cè)到編輯克隆。然而，當(dāng)根據(jù)新月柄桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化_SpCas9編碼序列（命名為_SpCas9M）后，基因編輯效率可達(dá)到15%左右。

其次，研究團(tuán)隊(duì)通過調(diào)控_SpCas9M的表達(dá)水平來提升編輯效率。研究人員測(cè)試了兩種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，香草酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（Pvan）和木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（Pxyl），檢測(cè)不同誘導(dǎo)劑濃度下的基因編輯效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)較低的_SpCas9M表達(dá)水平更有利于新月柄桿菌的基因組編輯，編輯效率最高可達(dá)到40%左右。

最后，通過分析未發(fā)生基因組編輯的克隆中的編輯質(zhì)粒，研究人員驚奇的發(fā)現(xiàn)這些克隆的_SpCas9M編碼序列均存在缺失。這一現(xiàn)象證實(shí)了CRISPR/_SpCas9系統(tǒng)的致死性，并表明新月柄桿菌中存在著強(qiáng)烈的選擇性壓力?；诖耍芯咳藛T提出假設(shè)：通過預(yù)先識(shí)別并排除這些_SpCas9M突變體，可有效提升在新月柄桿菌中的表觀編輯效率。為此，研究人員在_SpCas9M的C端融合了超折疊綠色熒光蛋白（sfGFP）作為報(bào)告系統(tǒng)，通過熒光信號(hào)指示，在菌落PCR前篩選并排除_SpCas9M異常表達(dá)的克隆。最后，總體實(shí)現(xiàn)編輯效率達(dá)到80%左右，研究團(tuán)隊(duì)將其命名為CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)。

應(yīng)用1：基因的單敲除、雙敲除和敲入

在新月柄桿菌中，不對(duì)稱細(xì)胞分裂由一對(duì)激酶（DivJ）和磷酸酶（PleC）協(xié)同調(diào)控。DivJ與PleC在細(xì)胞兩極的差異性定位形成磷酸化梯度，從而調(diào)控子代細(xì)胞的命運(yùn)決定。值得注意的是，DivJ和PleC的極性定位并非主動(dòng)過程，而是通過不同腳手架蛋白介導(dǎo)的招募機(jī)制實(shí)現(xiàn)。已有研究表明，位于細(xì)胞舊極的DivJ由PopZ-SpmX腳手架蛋白復(fù)合體招募，而位于細(xì)胞新極的PleC則通過腳手架蛋白PodJ實(shí)現(xiàn)定位。

為在遺傳學(xué)層面驗(yàn)證上述蛋白互作關(guān)系，研究人員利用CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)對(duì)新月柄桿菌中的_spmX和_podJ基因分別進(jìn)行了敲除。隨后，研究人員將mCherry熒光標(biāo)記的DivJ和PleC蛋白分別轉(zhuǎn)化至上述敲除菌株中，并利用倒置熒光顯微鏡觀察其定位情況。通過柄狀結(jié)構(gòu)指示細(xì)胞極性發(fā)現(xiàn)：在野生型菌株中，DivJ-mCherry特異性富集于細(xì)胞舊極，而PleC-mCherry則特異性定位于細(xì)胞新極；然而，當(dāng)_spmX基因被敲除后，DivJ-mCherry喪失極性定位能力；類似地，敲除_podJ基因后，PleC-mCherry在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)彌散性分布。上述結(jié)果表明，腳手架蛋白SpmX和PodJ通過直接相互作用維持DivJ/PleC的極性定位。

研究人員還依次敲除_podJ和_spmX基因構(gòu)建了雙突變菌株，雙突變株ΔpodJ-ΔspmX中DivJ-mCherry與PleC-mCherry均呈現(xiàn)彌散分布。值得注意的是，敲除podJ不影響DivJ-mCherry的定位，敲除spmX也不影響PleC-mCherry的定位，表明腳手架蛋白與信號(hào)蛋白間存在正交調(diào)控關(guān)系。

迄今為止，科學(xué)家尚未能實(shí)現(xiàn)新月柄桿菌中無標(biāo)記的基因插入。為解決這一難題，研究人員應(yīng)用CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)測(cè)試了靶向基因插入的可行性。利用基因敲入進(jìn)行功能獲得性研究時(shí)，研究人員選擇中性插入位點(diǎn)（Neutral Insertion Site, NIS）以避免基因極性效應(yīng)。研究人員通過targetFinder鑒定出一組新月柄桿菌潛在中性插入位點(diǎn)，并選取評(píng)分最高的NIS位點(diǎn)。當(dāng)利用CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)將Pcat-mcherry敲入到中性位點(diǎn)后，倒置熒光顯微鏡下可觀察到菌株內(nèi)的mCherry紅色熒光信號(hào)，證實(shí)該基因被正確插入且有效轉(zhuǎn)錄翻譯。此外，敲入菌株均未檢測(cè)到明顯的生長(zhǎng)及形態(tài)學(xué)改變，表明這些插入位點(diǎn)不會(huì)對(duì)新月柄桿菌的適應(yīng)性造成顯著影響。

應(yīng)用2：在中華根瘤菌和農(nóng)桿菌中應(yīng)用CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)

作為新月柄桿菌的近緣物種，中華根瘤菌（S. meliloti）與農(nóng)桿菌（A. fabrum）分別是植物共生菌與病原菌，二者在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中均具有重要價(jià)值。其中，苜蓿中華根瘤菌近年來還被用作天然產(chǎn)物發(fā)酵的細(xì)胞工廠。然而，由于缺乏有效的細(xì)胞同源重組活性，這兩種細(xì)菌均面臨高效基因編輯的難題。近來，針對(duì)農(nóng)桿菌與中華根瘤菌已分別開發(fā)出基于CRISPR的堿基編輯器與轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因組編輯工具。盡管如此，對(duì)于經(jīng)典的基因敲除與插入仍是該領(lǐng)域面臨的重要技術(shù)挑戰(zhàn)。

為此，研究人員測(cè)試了CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)在農(nóng)桿菌與中華根瘤菌中的編輯能力。實(shí)驗(yàn)選擇編碼胸苷激酶的tdk基因作為靶標(biāo)，該酶通過將5-氟-2′-脫氧尿苷（5-FUdR）磷酸化為毒性類似物氟-dUMP（F-dUMP），使細(xì)胞對(duì)5-FUdR敏感。為驗(yàn)證編輯菌株表型，在含200 μg/ml 5-FUdR的PYE平板上進(jìn)行生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：Δtdk菌株可在含5-FUdR的平板上存活，而野生型中華根瘤菌與農(nóng)桿菌則無法生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究開發(fā)的CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)相較于現(xiàn)有工具展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，其成功應(yīng)用于中華根瘤菌與農(nóng)桿菌等農(nóng)業(yè)重要微生物的基因組編輯，表明該系統(tǒng)可進(jìn)一步擴(kuò)展至微生物組研究或生物制造領(lǐng)域相關(guān)的其他遺傳操作困難物種。此外，該系統(tǒng)支持快速、迭代的遺傳操作，為基因功能研究與合成通路構(gòu)建提供了理想工具。未來，對(duì)CRISPR逃逸機(jī)制的深入解析將指導(dǎo)設(shè)計(jì)更為穩(wěn)健的CRISPR/Cas工具。CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)的建立不僅彰顯了可靠基因組編輯平臺(tái)的重要性，更為微生物遺傳學(xué)、合成生物學(xué)及其他生物技術(shù)領(lǐng)域的創(chuàng)新發(fā)展提供了基礎(chǔ)。

中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員趙維、上海交通大學(xué)教授艾連中為本文共同通訊作者。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員孫敬賢、研究助理余昕為共同第一作者。本工作獲得了中國科學(xué)院院士趙國屏、中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員戴磊和山東大學(xué)教授王海龍的大力支持和幫助；本研究獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金，以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院科研計(jì)劃等多個(gè)項(xiàng)目的資助。

文章上線截圖

圖1. CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)的作用原理

圖2. CRISPR/_SpCas9M-報(bào)告系統(tǒng)的搭建過程

圖3. DivJ-mCherry和PleC-mCherry分別在單敲除突變體ΔpodJ和ΔspmX中的分布

圖4. DivJ-mCherry和PleC-mCherry在雙敲除突變體Δ_podJ-Δ_spmX中的分布

圖5. 在NIS位點(diǎn)敲入P_cat-mcherry后的表型鑒定

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圖6.?tdk敲除突變體的鑒定