Metabolic Engineering | 利用生物質(zhì)糖實(shí)現(xiàn)聚酰胺12的綠色合成
人工合成的聚酰胺作為一類重要的工業(yè)材料，在汽車制造、輸油管道、電子電器、運(yùn)動(dòng)器材及醫(yī)療等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用，全球市場(chǎng)規(guī)模超過(guò)1000億元人民幣。中國(guó)作為全球最大的聚酰胺材料消費(fèi)市場(chǎng)，年需求量達(dá)數(shù)百萬(wàn)噸。然而，合成聚酰胺12的核心化學(xué)單體長(zhǎng)期以來(lái)被少數(shù)幾家公司壟斷，給企業(yè)帶來(lái)較大的供應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。此外，聚酰胺12的合成依賴于石油提取，且生產(chǎn)過(guò)程對(duì)環(huán)境污染較大，因此，開(kāi)發(fā)更加綠色、可持續(xù)的聚酰胺12合成技術(shù)顯得尤為必要。
近日，由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所合成生物化學(xué)研究中心的Howard H. Chou課題組在Metabolic Engineering期刊上發(fā)表了題為“Biosynthesis of 12-aminododecanoic acid from biomass sugars”的重要研究成果。
生物合成聚酰胺12的化學(xué)單體12-氨基十二烷酸（ADDA）面臨兩大技術(shù)瓶頸：其一，中間體十二烷酸（DDA）對(duì)底盤細(xì)胞具有毒性；其二，過(guò)氧化副產(chǎn)物十二烷二酸（DDDA）的積累會(huì)降低產(chǎn)率且增加生產(chǎn)成本。本研究基于合成生物學(xué)原理，闡明了這兩個(gè)技術(shù)瓶頸的機(jī)制，并開(kāi)發(fā)了高產(chǎn)菌株。該項(xiàng)研究不僅深化了對(duì)DDA、ADDA和DDDA生物合成機(jī)理的理解，還為多種聚酰胺的綠色生產(chǎn)提供了新思路。
生物合成ADDA的研究目前主要使用植物油作為原料，面臨原料價(jià)格高、與食品生產(chǎn)形成資源競(jìng)爭(zhēng)以及伴生的溫室氣體排放與生物多樣性破壞等多種挑戰(zhàn)。此外，生物合成ADDA的過(guò)程中會(huì)積累大量的DDDA，其合成機(jī)制至今尚不明確（Schrewe et al., 2013；Ladkau et al., 2016；Ahsan et al., 2018）。盡管已有研究利用葡萄糖合成了471.5 mg/L的ADDA，但DDA的細(xì)胞毒性問(wèn)題仍限制了產(chǎn)量和產(chǎn)率的提升（Ge et al.，2025）。
雖然生物合成ADDA為聚酰胺12的可持續(xù)生產(chǎn)提供了新范式，但要實(shí)現(xiàn)綠色合成，仍需解決原料選擇、DDDA積累以及DDA細(xì)胞毒性等問(wèn)題。
解決DDA的細(xì)胞毒性問(wèn)題
DDA添加和硫酯酶（UcfatB）表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，DDA對(duì)在生長(zhǎng)中的細(xì)胞具有毒性，并提示過(guò)度的UcfatB表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入不利于合成DDA的狀態(tài)。研究推測(cè)，利用群體感應(yīng)表達(dá)（QSE）系統(tǒng)可能有助于調(diào)節(jié)UcfatB表達(dá)，從而促進(jìn)DDA的合成。在細(xì)胞密度較低時(shí)，QSE系統(tǒng)可以在細(xì)胞較敏感的早期生長(zhǎng)階段將UcfatB表達(dá)維持在較低水平，避免細(xì)胞毒性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)DDA的積累。隨著細(xì)胞密度的增加，在敏感階段過(guò)后再提高UcfatB表達(dá)，可以最大化DDA的產(chǎn)量。與組成型表達(dá)系統(tǒng)相比，使用QSE系統(tǒng)在不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的情況下提高了DDA的產(chǎn)量。通過(guò)結(jié)合烷烴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AlkL）與QSE系統(tǒng)，進(jìn)一步優(yōu)化了該系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)性能，提高了表達(dá)強(qiáng)度和均勻性，并且降低了背景表達(dá)水平。
解決DDDA積累的問(wèn)題
在將DDA轉(zhuǎn)化為ADDA的過(guò)程中，中間體12-氧代十二烷酸可能被不可逆地氧化為DDDA。過(guò)往研究證明，在大腸桿菌中敲除具有醛還原或氧化活性的酶可以提高芳香醛的積累（Kunjapur et al.，2014；Butler et al.，2023）。本研究通過(guò)敲除16個(gè)醛脫氫酶和還原酶，成功減少了DDDA的積累。
利用葡萄糖和纖維二糖合成ADDA
基于對(duì)DDA細(xì)胞毒性和DDDA合成機(jī)制的深入理解，研究人員對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了改造，使其能夠?qū)⑵咸烟呛屠w維二糖轉(zhuǎn)化為ADDA，同時(shí)減少DDDA的積累以及DDA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)面影響。在以纖維二糖為主要碳源的條件下，菌株M997實(shí)現(xiàn)了509 mg/L的ADDA產(chǎn)量。菌株M1001在15升發(fā)酵罐中達(dá)到了1035 mg/L，從糖到ADDA的轉(zhuǎn)化率為5%，且未檢測(cè)出DDDA的積累。
為了實(shí)現(xiàn)從葡萄糖和纖維二糖合成ADDA的一步法發(fā)酵工藝，本研究闡明了生物合成ADDA的瓶頸問(wèn)題機(jī)制，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)中的細(xì)胞對(duì)DDA積累速率比最終DDA濃度更為敏感，解析了對(duì)DDDA積累的關(guān)鍵基因。研究通過(guò)改善QSE系統(tǒng)的性能，更嚴(yán)格地調(diào)控酶的轉(zhuǎn)錄，顯著提高了DDA和ADDA的合成效率。最后，開(kāi)發(fā)的一步法生產(chǎn)ADDA工藝實(shí)現(xiàn)了迄今為止從糖合成ADDA的最高產(chǎn)量和產(chǎn)率，為未來(lái)更可持續(xù)地生產(chǎn)ADDA、聚酰胺12及其它聚酰胺產(chǎn)品提供了新的思路。
中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院碩士畢業(yè)生高海鑫及研究助理方強(qiáng)為文章共同第一作者，正高級(jí)工程師Howard H. Chou為文章的通訊作者。本研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)自然科學(xué)基金、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院以及深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施的支持。
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論文上線截圖
圖 1.優(yōu)化了QSE系統(tǒng)來(lái)精細(xì)控制DDA的合成。(a)OD600和DDA產(chǎn)量由組成型啟動(dòng)子或基于QSE系統(tǒng)表達(dá)UcfatB。(b)基于QSE系統(tǒng)在不同誘導(dǎo)劑濃度下的表達(dá)強(qiáng)度。(c)對(duì)攜帶基于QSE系統(tǒng)并表達(dá)mCherry的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
圖 2. 解析DDDA合成的機(jī)制。（a）依次敲除7個(gè)醛脫氫酶，以及(b) 單獨(dú)敲除9個(gè)醛氧化酶或還原酶對(duì)DDDA積累的影響。
圖 3. 高效從糖合成ADDA的菌株。(a) M631在表達(dá)與OsmY融合的β-葡萄糖苷酶（M997）并以纖維二糖為主要碳源。(b) M1001的發(fā)酵結(jié)果。
